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FAOBlue脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑應(yīng)用實(shí)例

更新時(shí)間:2024-08-14   點(diǎn)擊次數(shù):992次

應(yīng)用實(shí)例

一、FAOBlue及其香-豆-素衍生物的吸收光譜和熒光光譜

在PBS緩沖液(pH 7.4)中,F(xiàn)AO代謝后釋放的FAOBlue和香-豆-素衍生物的吸收光譜(左)、熒光光譜(右)。

FAOBlue經(jīng)過(guò)FAO轉(zhuǎn)化為香-豆-素衍生物后,吸收峰從FAOBlue發(fā)生偏移至405 nm。因此,在405 nm的激發(fā)條件下,F(xiàn)AOBlue不會(huì)發(fā)出熒光,只有在通過(guò)FAO釋放香-豆-素衍生物時(shí)才會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。

注:FAOBlue在300-380 nm(最大350 nm)激發(fā)時(shí)顯示藍(lán)色熒光(灰色線,370-450 nm),所以在選擇濾光片時(shí)請(qǐng)格外注意,避免同時(shí)激發(fā)未反應(yīng)的FAOBlue以及FAO反應(yīng)后的香-豆-素衍生物。

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二、各種癌細(xì)胞中FAO活性可視化

在4種癌細(xì)胞中加入FAOBlue,培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行熒光觀察。所有細(xì)胞都出現(xiàn)藍(lán)色熒光,而經(jīng)過(guò)FAO抑制劑etomoxir處理后藍(lán)色熒光顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明,藍(lán)色熒光是由活細(xì)胞中FAO活性引起的。(注:實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型不同而不同)

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HepG2 : 5 μM, 30 min、 LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min


三、藥物對(duì)FAO活性的干擾

對(duì)HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行AICAR(通過(guò) AMPK 激活的 FAO 激活劑)和ranolazine(部分 FAO 抑制劑)處理,隨后加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞(未處理)相比,AICAR處理后明顯增加藍(lán)色熒光強(qiáng)度,ranolazine處理后則明顯降低藍(lán)色熒光強(qiáng)度。

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四、藥物對(duì)FAO活性影響的定量分析

將HepG2細(xì)胞與不同濃度的ND630預(yù)孵育4小時(shí)。ND630處理后,加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結(jié)果表明,伴隨ND630濃度增加,藍(lán)色熒光強(qiáng)度隨之增加。由此可知,ND630可增強(qiáng)FAO活性。(注:ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制劑,被認(rèn)為是治療非酒精性脂肪肝(NAFLD)的潛在藥物)

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五、NASH模型小鼠的FAO活性分析

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種與脂質(zhì)相關(guān)的疾病,表現(xiàn)為脂肪酸代謝活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強(qiáng)脂質(zhì)代謝的bezafibrate后,提取原代肝細(xì)胞。向各組細(xì)胞加入FAOBlue(5 μM)觀察其FAO活性,結(jié)果顯示,相較正常小鼠來(lái)源細(xì)胞,NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞的FAO活性明顯被抑制。另外,給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞中FAO活性被恢復(fù)。

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產(chǎn)品文獻(xiàn)

Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.

 

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